近年来规模化牧场已成为生产主体，牛奶的规模化生产能够保证奶牛、饲料、技术等的一致性，但不同地区的环境因素仍会造成牛奶中脂肪、蛋白质等品质指标存在差异，进而导致不同牧场牛奶之间的风味差异。牛奶风味是决定消费者购买与否的重要因素之一。目前关于牛奶风味的研究大多集中在不同杀菌方式的比较方面，对于不同地区牧场牛奶风味差异的研究较少。
        本研究以4个不同感官特性牧场的牛奶为研究对象，采用CATA法、GC-MS以及GC-MS-O联用技术研究了牛奶的感官特征和挥发性风味物质。采用单因素方差分析、对应分析（CA）和偏最小二乘回归（PLSR）等方法，分析影响不同牧场牛奶感官差异的香气活性化合物，以期为实际乳品工业中的牛奶感官品质的控制提供进一步的理论参考。
        一、材料与方法
        01 材料与试剂
        从河北的6个牧场获取6份牛奶样品，通过初步感官评价（数据未显示）筛选出4种感官差异较大的牛奶样品，分别标记为一牧、二牧、三牧、四牧（表1）。
        02 挥发性风味物质的提取
        利用SPME-Arrow萃取头进行风味化合物的萃取，并对提取工艺参数进行优化。经优化后的条件：10g样品置于40mL的顶空瓶中，向其中加入1g氯化钠提高萃取效率，并向其中添加1μL质量浓度为0.816mg/mL的2-甲基-3-庚酮作为内标。在45℃水浴锅中平衡20min后，利用SPME-Arrow的萃取头吸附30min，在GC-MS中解吸5min。
        03 GC-MS条件
        色谱条件：DB-WAX型毛细管柱（60m×0.25mm，0.25 μm），以氦气作为载气，设置恒定流速1.2mL/min。升温程序：起始柱温为40℃，以4℃/min升温到230℃，维持2min。采用不分流模式。
        质谱条件：电子电离（electronionization，EI）源，电子能量70eV；进样口温度250℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃；全扫描模式，质量扫描范围m/z35～350。
        04 GC-MS-O条件
        采用配备嗅觉检测端口的GC-MS。高纯氮气（99.99%）作为GC-O分析的载气。嗅闻口与质谱仪进样分流比1∶1，嗅闻口和传输线的温度分别保持在230℃和250℃，在检测口通入湿润的空气。其他条件同1.3节GC-MS条件。由4名有牛奶感官经验的小组成员进行，针对牛奶香气物质对评价员进行额外12h培训（每周3h，共4周）。嗅闻时，实时记录香气化合物出现的时间、气味特征以及气味强度（aromaintensity，AI）。参考文献方法并进行调整，将AI分5个等级，分别以0、1、2、3、4分的形式表示香气强度，“0”表示未识别到任何气味，“1”表示可以准确识别气味但持续时间短，“2”表示能快速识别气味且持续时间长，“3”表示能准确快速识别气味且持续时间较长，“4”表示能准确快速识别气味且持续时间更长。如果2个及其以上的小组成员感知到气味，就确定一个香气活性物质。
        05 定性定量分析
        采用NIST14谱库、计算化合物的保留指数（retentionindex，RI）与文献中的保留指数进行对比以及比对嗅闻结果对牛奶中化合物进行定性分析。RI计算：将正构烷烃C7～C30与牛奶在相同的色谱条件下得出GC保留时间，根据公式计算待测物i的RI（tn＜ti＜tn＋1）：
        式中：n为碳原子数；tn为碳原子数为n的正构烷烃的保留时间；tn＋1为碳原子数为n＋1的正构烷烃的保留时间；ti为样品i的保留时间。
        定量分析：内标半定量法，根据化合物及内标化合物峰面积比值计算各挥发性组分的浓度。对嗅闻得到的香气活性物质进行内标标准曲线法（内标为2-甲基-3-庚酮）精确定量。
        06 感官评价
        从北京工商大学学生中招募到50名未经培训的消费者（18名男性和32名女性，年龄19～25岁）完成CATA问卷（图1）。实验开始前，每个参与者都签署了一份知情同意书，参与者均具有长期饮用牛奶的习惯（每周至少5次）。并对招募的消费者评价员进行实验所需的流程介绍以及感官评价等基本知识培训。
        CATA问卷中的感官属性在文献及实验室感官评价专家小组讨论确定的基础上，再由10名消费者集体讨论，根据样品本身的属性以及参与者的语言习惯对描述词进行调整后最终确定。在回答完每个评估样本的CATA问题后，参与者还需要使用1～9分的享乐量表对样品的总体喜爱程度进行评分。
        将4份15mL的牛奶样品置于30mL的品评杯中。样本随机3位数编码呈送给参与者。期间还提供了无盐饼干和瓶装净水清洁口腔。
        07 数据处理
        采用单因素方差分析比较GC-MS测得的挥发性风味物质的半定量及精确定量结果，并采用Tukey事后比较法进行统计学分析（以P＜0.05表示差异显著）。CATA数据以感官属性的频率表示，通过具有显著差异的气味描述词进行CA，将气味属性的频率和4个牛奶样本之间的相关性可视化。使用PLSR，以探索CATA气味感官属性（频率）与香气活性物质之间的关系。利用IBMSPSSStatistics23、SIMCA14及Origin2018等软件进行数据处理及图像绘制。
        二、结果与分析
        01 牛奶样品的感官分析
        50名参与者通过CATA问卷对牛奶样品的感官属性进行勾选，表2显示了4个牛奶样本的22个感官属性描述词的使用频次，包括10个气味、4个滋味、4个口感和4个外观。其中描述气味的奶香味、奶油味，描述滋味的甜味，描述口感的醇厚以及描述外观的流动性好为参与者勾选最多的描述词，而气味描述词纸板味，滋味描述词回味-涩味、口感描述词颗粒感和外观描述词流动性差则是勾选频率最低的。由表3可知，4个牧场牛奶样品喜好度评分均存在显著差异（P＜0.05）。以上表明参与者倾向于使用奶香味、奶油味、甜味变量描述牛奶样品的风味，它们是牛奶中普遍存在的风味属性，也是消费者所喜爱的风味属性。
        此外，根据Cochran’sQ-test，在10个气味属性中，50位参与者能够显著区分4个牛奶样品中的7个气味属性，分别为奶香味、奶油味、香甜味、奶腥味、塑料味、蒸煮味、金属味，在回味-奶香味、氧化味和纸板味的气味属性上没有显著差异。利用CA将7个气味属性与来自4个牧场的牛奶样品之间的关系可视化（图2）。CA的结果显示F1和F2的总解释量为96.25%。一牧牛奶样本位于第2象限，与奶油味和奶香味CATA变量呈正相关，且喜好度评分最高（表3）。二牧位于第3象限，与香甜味有关。三牧则位于第1象限，其喜好度评分最低，与金属味、塑料味呈正相关，而四牧位于第4象限，与奶腥味、蒸煮味、氧化味等不愉快的气味有较强的相关性。综上所述，4个牧场牛奶样品感官差异明显，未经训练的小组成员可以很好地将其进行区分。
        02 4个牧场牛奶风味物质的GC-MS分析
        采用HS-SPME-Arrow-GC-MS初步分析造成4个牧场牛奶样品感官差异的挥发性风味物质，图3A清楚地显示了4个牧场牛奶样品的挥发性风味物质数量，共鉴定出37种挥发性物质，包括酸类11种、酮类3种、醇类11种、醛类6种、酯类2种以及萜烯类2种、含硫化合物1种和酚类物质1种。一牧和二牧的风味物质比三牧和四牧多，4个样品被检测出17种相同的成分。将4个样品中风味物质的种类通过含量进行比较，如图3B所示。可以看出，一牧牛奶样品风味物质释放含量明显高于其他3个牧场，三牧和四牧样本间的差异相对较小。其中一牧的酸类和酮类物质含量最高，牛奶中的酸类物质来源于脂肪分解、乳糖和氨基酸的降解，而牛奶中的挥发性脂肪酸一般是指含偶数碳的中短链脂肪酸，如丁酸、己酸、辛酸等。此外，酸类除了能够作为挥发性物质外，还是酮类化合物的前体物质，酮类主要由热加工过程中的脂肪降解和游离脂肪酸经氧化为β-酮酸后脱羧反应产生。二牧中的醛类化合物含量在4个样品中最高，牛奶中的醛类化合物主要来源于脂肪酸代谢、氨基酸转氨作用或Strecker降解。醇类和酯类在所有样品中均较少，牛奶中的醇类物质可能来源于化学降解，也可能是由于微生物的活动产生的，醇类的风味阈值较醛类高，因此对风味的影响较醛类物质低。
        为更直观地分辨4个牛奶样品间的差异，基于其风味物质的定性定量结果，对样品进行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）（图3C），PC1和PC2分别解释了55.6%和29.3%的方差，两个PC总方差贡献大于80%，可以基本反映样品整体信息。不同样品在PC1上有较大差异。三牧和四牧在PC1上投影较近，挥发性风味物质较为相似，一牧、二牧则与上述两个样品相距较远，表明挥发性风味物质差别较大。与一牧相关的挥发性物质最多，均存在PC1的负轴上，如中短链脂肪酸、2-庚酮、壬醛等。而二牧与3-己醇、辛醇、糠醛、苯乙烯、苯甲酸等物质距离较近。三牧和四牧与2-戊醇、柠檬烯、己醛、苯乙酮等挥发性物质聚集在一起。其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、己醛、柠檬烯、苯乙烯在韩兆盛等的研究中也有发现，因此，这可能是造成牛奶感官差异的风味物质。         03 4个牧场牛奶香气活性物质的GC-MS-O分析
        基于GC-MS从牛奶样品中共鉴定出37种挥发性风味物质，为进一步确定引起4个牧场牛奶样品感官差异的主要香气活性物质，本研究进一步采用GC-MS-O技术从中分析出AI≥1的14种气味活性物质，并通过标准曲线计算这些香气活性物质在牛奶中的精确含量（表4），其中包括酸类7种（乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二酸）、酮类2种（2-庚酮和苯乙酮）、醛类2种（己醛和癸醛）、醇类1种（1-辛烯-3-醇）以及萜烯类2种（柠檬烯和苯乙烯）。         为更清晰地了解4个牧场牛奶样品香气活性物质浓度的异同，对4个牧场牛奶样品的14种香气活性物质的精确定量结果进行热图和层次聚类分析，结果如图4所示。横向代表不同样品间的浓度差异，纵向聚类结果代表14种成分间的浓度差异关系，热图颜色由蓝至红反映各成分浓度由低至高。4个牧场牛奶样品热图聚类分析结果显示，一牧牛奶样品聚为第一类，说明一牧牛奶样品的香气活性物质分布不同于其他3个牧场，这主要与其短链脂肪酸含量显著高于其他3个牧场有关（P＜0.05）。它们分别为乙酸（AI＝1.5，63.55 μg/kg）、丁酸（AI＝2，22.31 μg/kg）、己酸（AI＝2，51.06 μg/kg）、辛酸（AI＝2.5，125.55 μg/kg）、壬酸（AI＝1.5，8.79 μg/kg）、癸酸（AI＝2.5，72.21 μg/kg），这些脂肪酸广泛存在于牛奶中，其中丁酸在低浓度下具有较为浓郁的奶香味，此外，苯乙酮（AI＝1，24.82 μg/kg）在一牧中的含量也最高，苯乙酮由苯基丙氨酸的β-氧化形成酮酸后经脱羧生成，且苯乙酮与奶酪的香气强度呈正相关。二牧聚为第二类，其中的十二酸（AI＝1，27.72 μg/kg）和柠檬烯（AI＝2.5，20.26 μg/kg）含量显著高于其他牧场（P＜0.05），这可能是引起差异的主要香气活性物质，萜烯类化合物通常具有水果味、草本味或树脂味，Fernandez-Garcia等报道了法国高原地区采集的牛奶中萜烯类浓度均高于平原地区。因此4个牧场牛奶样品间萜类物质浓度的差异可能是由于地区不同。三牧和四牧聚为第3类，表示其香气活性物质分布整体上没有显著差异，这与两者的香气活性物质含量普遍偏低有关。但从表4的定量结果可以得出己醛（AI＝2，52.89 μg/kg）和癸醛（AI＝1，36.06 μg/kg）在三牧中的含量均最高，醛类化合物在低浓度时，会产生令人愉悦的草本气味，且1-辛烯-3-醇是嗅闻得到唯一的醇类物质且仅在三牧中出现，它具有典型的蘑菇香气，超过适当的浓度水平，会使牛奶有金属味。以上聚类结果与图3C结果一致，表明这14种香气活性物质是引起4个牧场牛奶感官差异的主要贡献者。         04 牛奶样品香气活性物质与感官特性的相关性分析
        基于PLSR的模型分析气味CATA变量（Y变量）与香气活性物质（X变量）之间的相关性。PLSR结果如图5所示。仅使用样本间差异显著的气味CATA变量进入模型。双组分R2X（cum）值在0.630～0.807之间，R2Y（cum）值在0.788～0.968之间。PLSR模型中的Q2值用于揭示气味属性（Y变量）和化合物（X变量）之间的相关性。结果显示：一牧奶香味和奶油味较为明显，这是令人愉悦的气味特征，与短链脂肪酸类化合物，如丁酸、己酸、辛酸、癸酸以及2-庚酮等相关性较大，艾娜丝等在分析全脂巴氏乳挥发性成分中得到了相似的结果；二牧具有香甜味，与柠檬烯相关性较大，也是令人愉悦的气味；三牧具有塑料味、奶腥味、金属味的气味特性，其中金属味与1-辛烯-3-醇相关性较大，与潘明慧等的研究结果一致。四牧的蒸煮味较强，与苯乙烯、己醛的相关性较大，在Hedegaard等对3种不同脂肪酸组分的牛奶的研究中同样也发现蒸煮味与己醛高度相关。此外，三牧和四牧喜好度评分较低，己醛、苯乙烯、1-辛烯-3-醇与其有较大的相关性，这些物质可能是令人不愉快的气味来源。         来源：感官科学与评定
        参考文献：韩颢颖，王亚东，韩兆盛，王蓓，付翠霞，赵爽，乔琳雅，姚欢. 基于CATA和GC-MS-O的不同牧场牛奶感官特性及香气活性物质分析[J]. 食品科学, 2024, 45(1): 143-149.